从而对机体生长造成危害

［1］

．大量的研究表明

，

世界各大水体均受到了不同程度的 EDCs

（ Endo-

crine Disrupting Compounds

）污染，而且导致了水

体中野生生物尤其是鱼类的调节机制紊乱

，出现

畸形化、雌性化的趋势

［2 － 4］

．

近年来

，松花江鱼类数量锐减，种类变少，鱼

病盛行

，畸形鱼数量增加，生态系统遭到破坏，水

生生物的生存受到严重威胁

［5］

．本文采用固相萃

取

（ SPE）富集、气质联机（ GC － MS）和重组基因

酵母

（ YES）技术检测了松花江水中典型 EDCs 的

质量浓度及雌激素活性

，为了解松花江水体 EDCs

的污染状况

，控制 EDCs 污染的对策，以及保护和

恢复松花江水体的鱼类资源提供了科学依据．

实

验

1. 1

采样点及样品采集

沿松花江全江进行了 11 个站位的样品采集

，

～ S

（梢口和松花江村）位于上游吉林省，S

～

（肇源、哈上、哈下、达连河上、达连河排污口和

达连河下

）位于中游哈尔滨江段，S

～ S

（佳上、

佳下和同江

）处于下游江段．采样时间为 2009 年

3 月份松花江冰封期内．在冰下水深 0. 5 m 处

，采

集水样 4 L 于密闭的铁桶中

，取回实验室后立即

用0. 7 μm的玻璃纤维滤膜过滤，再用硫酸酸化至
pH ＜ 2 以避免微生物降解

，4 ℃ 下保存，所有水样

均在样品采集后 3 d 完成前处理．

1. 2

样品前处理

采用 Oasis HLB

（ 200 mg，6 mL）固相萃取柱

富集水样内分泌干扰物

［6］

．柱子调节

：用 5 mL 乙

酸乙酯过柱以去除残留的键和剂

，5 mL 甲醇浸泡

5 min

，再用 10 mL 盐酸溶液（ pH = 3）以 1 mL /min

流速过柱．水样富集

：取调节 pH 为 3 的水样

2 000 mL

，通过控制固相萃取系统的真空度，使水

样以 8 mL / min 的流速过柱

，随后用 10 mL 超纯水

－甲醇

（ 9∶ 1）洗柱，继续真空干燥 1 h．洗脱：干燥

后的 SPE 柱

，用 10 mL 乙酸乙酯以 1 mL /min 流

速洗脱到 15 mL 的玻璃管中

，经无水硫酸钠脱水

后

，于 45 ℃ 用微氮气流缓慢浓缩至 1 mL．其中，

0. 5 mL 置于色谱瓶中

，用氮气吹干后加入 50 ng

的 BPA － d16 作为内标

，同时加入 100 μL 的衍生

剂于 70 ℃ 水浴中反应 60 min

，稀释到 0. 5 mL 待

测

；另外 0. 5 mL 于微氮气流下吹干后，溶解到

0. 5 mL 的 DMSO 中用于测定水样的雌激素活性．

1. 3

EDCs 化学分析

采用气相色谱－质谱法分析内分泌干扰物的

质量浓度

［7］

．仪器型号

： HP6890 － 5973，HP － 5MS

毛细管柱

（ 30 m × 0. 25 μm × 0. 25 μm）．以氦气为

载气

，流速 1 mL /min，进样口温度 250 ℃ ．升温程

序

：初始炉温 100 ℃ ，保持 1 min，随后以

10 ℃ / min到 200 ℃

，再以 3 ℃ /min 到 280 ℃ ，保

持2 min．不分流进样

，进样量 2. 0 μL．质谱接口温

度 280 ℃

，离子源温度 250 ℃ ，EI 源电离，以全扫

描模式定性

，选择离子模式进行定量．

固定内标量为 100 μg /L，一系列质量浓度的

EDCs 混标

（ 2、5、10、50、100、500 μg /L）用于确定

线性质量浓度范围

，并获得了很好的相关性

（ R

＞ 0. 995

）．用校准曲线计算未知样品的质量

浓度． 3 个 100 ng / L 标准平行水样用于测定方法
的回收率及标准偏差．水样中除 EE

外其他物质

的平均回收率均大于 70%

，相对标准偏差为

5% ～ 17% ．

1. 4

雌激素活性测定

雌激素活性采用中科院生态环境中心建立的

酵母双杂交雌激素活性评价方法

［8］

，试验用的酵母

菌由王子健教授惠赠．试验方法详见文献

［8］．简述

如下

：将酵母菌置于 SD 培养基中，在 30 ℃ 、

130 r / min条件下培养 36 h．并用 SD 培养液稀释至

600

值为 0. 75 左右

，吸取菌液 0. 995 mL 于1. 5 mL

灭菌离心管中

，加入 5 μL 待分析的样品，混匀．每

个样品设 8 个梯度

（浓缩液稀释倍数： 1、1/2、1/10、

1 /20、

1 /100、

1 /200、

1 /1 000、1 /10 000

），每个梯度

做 3 个平行测试．随后由离心管吸取 200 μL 菌液
至 96 孔板中

，在 30 ℃ 、800 r /min条件下暴露 2 h．

测定菌悬液的 OD

600

值

，随后每孔弃去 150 μL，加入

120 μL 测试缓冲液和 20 μL 氯仿，

于1 200 r / min震

荡破壁 15 min

，加入 40 μL ONPG，于 30 ℃ 、

800 r / min下培养显色 60 min．显色结束后

，每孔加

入100 μL碳酸钠溶液（ 1 mol /L），终止反应．吸取上
清液 200 μL 至新 96 孔板中，测定420 nm处吸光
度．同时

，以 DMSO 做阴性对照，以 E

为阳性对照．

β －乳糖苷酶活性按下式计算：

U =

420

－ A'

420

t × V × A

600

× 1 000．

（ 1）

式中

： t 为加入 ONPG 到溶液显色时的反应时间，

min

； V 为菌液体积，mL； A

600

、A

420

分别为菌液在

600、

420 nm 处的光密度值

； A '

420

为空白对照在

420 nm处的光密度值．

对于处理的样品

，由剂量效应曲线可计算出样

品的 EC

值．样品的雌激素活性可用雌二醇当量

（ ρ

EEQ

）来表达，可用下式计算：

EEQ

，E2

，样品

．

（ 2）

第 12 期

张照韩

，等：松花江水内分泌干扰物及雌激素活性调查