水平 。试剂盒由晶美生物工程公司提供 。
1. 2. 2 V E GF mRNA 表达的检测 收集取卵日全
部卵泡液 (无血细胞污染) ,离心去除上清夜 ,将沉淀
之颗粒细胞用 PBS 稀释后吸至淋巴细胞分离液上
面 ,离心 ,颗粒细胞层位于两种液体界面之间 。最后
将颗粒细胞吸入一无菌 Eppendorf 管中 , - 80 ℃保
存备用 。常规方法提取颗粒细胞总 RNA ,采用 R T
2
PCR 技术 ,测定 RNA 的含量 。逆转录 ( R T) 反应 :
20μL 反应体系包括 MgCl
2
4 μL 、
10 ×RNA PCR
Buffer 2μL 、
dN TP Mixt ure 2μL 、
RNase Inhibitor 0.
5 μL 、
Random 9mers 1 μL 、
Reverse Transcriptase 1
μL 、
实 验 样 品 1 μg 。逆 转 录 反 应 条 件 : 30 ℃ 10
min ,42 ℃ 30 min , 99 ℃ 5 min ,5 ℃ 5 min 。反应
结束后加以下试剂进行 PCR 扩增 : MgCl
2
6. 0 μL ,
10 ×RNA PCR 缓冲液 8. 0 μL , 灭菌蒸馏水 61. 5
μL , Ta KaRa Taq 酶 0. 5μL ,V EGF 上游及下游 PCR
引物各 1. 0μL ,β
2actin 上游及下游引物各 1. 0μL 。
V E GF PCR 引物 (由大连宝生物工程公司合成) 上
游 序 列 : 5′
2CGAA GTGAA GTTC2ATGGATG23′,下
游 序 列 : 5′
2TTCTGTATCA GT2CTTTCCTGGT23′。
β
2actin 上 游 引 物 序 列 : 5′2GTGGGGCGCC2
CCA GGCACCA
23′, 下 游 序 列 : 5′2CT2CCTTAAT2
GTCAC GCAC GA T T TC
23′。VEGF 目标基因 : 390
bp ,β
2actin 目标基因 : 500 bp 。循环条件 : 94 ℃ 1
min ,62 ℃1 min ,72 ℃1 min共 28 个循环 ,最后 72
℃延伸 7 min 。反应结束后 ,以溴酚蓝作电泳指示
剂对 PCR 产物行琼脂糖凝胶电泳 ,并通过数字图像
分析仪进行 DNA 电泳条带光量子强度分析 。以
V E GF DNA 条带的面积与β
2actin DNA 条带的面积
比作为 V EGF mRNA 水平的参数 ,对 V EGF PCR
产物进行相对定量分析 。
2 结 果
2. 1 两组 V E GF 水平比较
HC G 注 射 日 O HSS 组 血 清 V E GF 水 平 与 非
O HSS 组比较差异无显著性 (
t
= 0
.
97
, P
> 0. 05) ;
O HSS 组胚胎移植日血清 、
取卵日卵泡液 V EGF 水
平均高于非 OHSS 组 ,差异有显著意义 (
t
= 3
.
37 、
2
.
19
, P
< 0. 01 、
0. 05) 。两组 HC G 注射日与胚胎移
植日 V EGF 水平比较 ,差异均有显著性 (
t
= 50
.
8 、
20
.
0
, P
< 0. 01) 。见表 1 。
2. 2 两组 V E GF mRNA 表达
电泳结果显示 ,OHSS 组 V EGF mRNA 表达量
为 0. 54 ±0. 24 ,非 OHSS 组为 0. 27 ±0. 12 。两组比
较差异有显著性 (
t
= 3
.
38
, P
< 0. 01) 。见图 1 。
表
1
两组
HCG
注射日 、
胚胎移植日血清及取卵日卵
泡液
VEGF
水平比较
(
ρ
/ ng
・
L
- 1
,
gh
x
±
s
)
组别
n
HCG
注射日
胚胎移植日
取卵日
非
OHSS
组
22
90. 23
±
34. 62 104. 18
±
20. 76
△
362. 50
±
231. 85
OHSS
组
14 102. 50
±
40. 80 150. 93
±
59. 91
3 △
782. 86
±
136. 87
3
与非
O HSS
组比较
,
3
t
= 3
.
37
、
2
.
19
, P
< 0. 01
、
0. 05 ;
与
HCG
注
射日比较
,
△
t
= 50
.
8
、
20
.
0
, P
< 0. 01
图
1
两组病人卵巢颗粒细胞
VEGF mRNA
基因表达
M
为相对分子质量标准
;
①为
O HSS
病人
V EGF mRNA
基因表
达
;
②、③、④为非
O HSS
病人
V EGF mRNA
基因表达
; 390 bp
处为
V EGF
目标基因
,500 bp
处为β
2
actin
目标基因
3 讨 论
近年来随着促超排卵药物的普遍使用 ,OHSS
发生呈上升趋势 。在接受促超排卵的病人中 ,OHSS
的发生率约为 20 % ,其中 ,中度与重度者占 1 %～
10 %
[ 1 ]
。OHSS 是药物诱发超排卵过程中出现的一
种严重的并发症 ,重度病人可危及生命 。国内外研
究显示 ,对药物促超排卵病人进行 OHSS 预测 ,及时
调 整 实 施 方 案 , 是 预 防 OHSS 发 生 的 最 佳 方
法
[ 2 ]
。
L udwig 等
[ 3 ]
对 10 例 重 度 OHSS 病 人 血 清
V E GF 检测结果显示 , HC G 注射日及胚胎移植日
O HSS 组较非 O HSS 组显著升高 ,并认为依据血清
V E GF 水 平 预 测 O HSS 发 生 准 确 率 为 80 %。A
2
grawal 等
[ 4 ]
研究显示 ,OHSS 病人血清 V EGF 水平
在注射 HCG 后 、
O HSS 症状出现之前就已明显高于
非 OHSS 病人 , HCG 注射日 、
取卵日 V EGF 升高是
O HSS 发生的重要标志 ; 并认为高水平的 V E GF 能
预测 OHSS 发 生 , 其 灵 敏 度 为 100 % , 特 异 度 为
60 %。本文结果显示 ,注射 HC G 日血清 V E GF 水
平 OHSS 组与非 OHSS 组相比差异无显著性 ;胚胎
移植日血清 V EGF 水平 OHSS 病人较非 OHSS 病
人显 著 升 高 。提 示 血 清 V EGF 水 平 与 OHSS 发
生 密切相关 。
胚胎移植日血清中V EGF水平升高可
作为预测 OHSS 发生的一个有效指标 。
・
1
7
3
・
齐鲁医学杂志
2003
年
12
月第
18
卷第
4
期
Med J Qilu , December 2003 , Vol. 18 , No . 4