叶 丽 虹 !等
!
不 同 转 移 能 力 乳 腺 癌 细 胞 株 的 差 异 表 达 蛋 白 研 究
通过建立并应用
"#$%
鼠 肿 瘤 转 移 模 型 !从 人
乳腺癌细胞系
&’()*
中筛选并建立了具有高转移
潜能的转移亚克 隆
+&)&’()*
"
,#
$
获 得 国 家 发 明 专
利!专利号
-+ ./0/0.12345
%&
在此基础上!应用含
有
10 /16
个 基 因 的 基 因 芯 片 ! 对
+&)&’()*
与
&’()*
细胞的基因表达谱进行了比较! 获得了
2*
个差异表达的基因!其中
/5
个文献 报 道 与 肿 瘤 有
关 !
6
个 与 乳 腺 癌 转 移 有 关 !
2
个 可 能 参 与 肿 瘤 浸
润和转移过程
"
1#
&
然而!它们在蛋白质表达水平上
的差异尚不清楚& 本研究采用蛋白 质 组 学 技 术 和
免疫印迹等方法检测了上述不同转 移 能 力 的 乳 腺
癌细胞株中蛋白质表达水平的差异! 并 进 行 其 功
能研究!旨在筛选乳腺癌转移相关蛋白!从而进 一
步阐明乳腺癌转移的分子机理&
!
材料与方法
!"!
材料
人乳腺癌细胞系
&’()*
为本实验室储备!
+&)
&’()*
细胞为本实验室建立
"
0#
!
均采用
78&$)0239
$
含 有
0.:
胎 牛 血 清 !
0.. !; < =>
硫 酸 链 霉 素 和
0.. ? < =>
青霉素%培养液!在
/*@
’
5: ’A
1
条件下
’A
1
培 养 箱 中 培 养 & 兔 抗 人
B=1/
多 克 隆 抗 体 $
0
(
/..
稀释%购 于
CD%4D$A4
公 司 !兔 抗 人
&+’E
多 克
隆 抗 体 $
0F0. ...
稀 释 % 购 于
"G;=H
公 司 ! 鼠 抗 人
存 活 蛋 白 单 克 隆 抗 体 $
0F3..
稀 释 %’ 兔 抗 人
DI>)1
多克隆抗体$
0F1..
稀释%’兔抗人
J1*
多克隆抗体
$
0F0 999
稀释%和鼠抗人
")K?L?>GB
单 克 隆 抗 体 $
0F
599
稀释%均购于
MNO&HPQNPR
公司& 克隆有存活蛋
白 $
R?PSGSGB
%
基因的
JI%MT/)"?P
质粒为本 实 验 室
制备
"
/#
!
JI%MT/
和
UV(8
质粒为本实验室储备&
!"#
蛋白样品制备
分别取对数生 长 期 的
+&)&’()*
和
&’()*
细
胞!用预冷的
8D"
洗
/
次& 加入适量
9415:
胰蛋白
酶溶 液 消 化 细 胞!
3 999 P < =GB
!
3@
离 心
,9 =GB
!
收
集细胞& 加入适量细胞裂解液$
3: ’WT8"
!
X =O> < +
尿素!
1: 8YHP=H>ZKN /),9
%
并加入蛋白酶抑制剂混
合 物 !
3@
作 用
/9 =GB
&
然 后
,/ 999 P < =GB
!
3@
离
心
,5 =GB
!
取上清& 测定蛋白浓度!
[*9@
保存&
!"$
第一向固相
%&
梯度等电聚焦电泳
用
JW/)09
的
$8V
胶 条 对 蛋 白 样 品 进 行 一 维
等电聚焦电泳& 分别取
+&)&’()*
和
&’()*
细胞
裂解液! 与重泡胀液 $
1: ’WT8"
!
X =O> < +
尿素!
945: $8V
缓冲液!
94991:
溴酚蓝%混合后加入持胶
槽!然后将胶条放于持胶槽中!将样品溶液从正 极
到负极均匀铺展!在加样后的胶条上覆盖一层
$8V
覆盖液& 然后按以下程序进行(重泡胀时
9\
!
1 Y
)
然后
/9 \
!
09 Y
)
初始化时
$U(599\
!
0 Y
!
然后
0 999
\
!
0 Y
)
达到稳定态后
$U(X999\
!
* Y
&
!"’
第二向
()(*+,-.
等电聚焦电泳结束后! 胶条置于平衡液
T
$
59
==O> < + CPGR)W’>
!
JWX4X
!
2 =O> < +
尿 素 !
/9:
甘 油 !
1: "%"
!
19 ==O> < + %CC
!
94991:
溴 酚 蓝 % 中 ! 摇 动
孵育
05=GB
&
然后置平衡液
D
$
59 ==O> < + CPGR)W’>
!
JWX4X
!
2 =O> < +
尿素!
/9:
甘油!
1: "%"
!
099 ==O> < +
碘乙酰胺!
94991:
溴酚蓝%中!摇动平衡
05 =GB
&
取
出胶条! 用二维电泳缓冲液 $
15 ==O> < + CPGR
!
061
==O> < +
甘 氨 酸!
940: "%"
%
洗 去 多 余 平 衡 液 !转 移
至
0145:
的
"%")8TVU
上进行二维电泳& 先
/9 =T
恒 流 电 泳
/9 =GB
!
再
29 =T
恒 流 电 泳 直 到 指 示 剂
抵胶底时结束&
940:
考马斯亮蓝
7)159
染液染色
1]/ Y
!
换脱色液!摇动脱色直至背景干净&
!"/
二维胶分析及质谱分析
对比分析两块
"%")8TVU
胶!从胶中切下明显
差 异 表 达 的 蛋 白 质 点 !经 脱 水 ’还 原 ’烷 基 化 和 脱
色处理后!采用胰酶原位消化胶块!提取消化 得 到
的 肽 段 ! 利 用
U"$)^_T%)CA(
质 谱 仪 分 析 并 在
&"%D
蛋 白 质 数 据 库 中 比 对 质 谱 分 析 得 到 的 肽 序
列标签以确定蛋白&
!"0
免疫印迹
参照文献报道的方法进行免疫印迹
"
/#
&
样品进
行
"%")8TVU
电 泳 后 !电 转 移 至
8\%(
膜 !然 后 封
闭’一抗’二抗反应!化学发光法显色!压片显影&
!"1
基因转染
采 用 脂 质 体 介 导 转 染 法 在
2
孔 板 中 将
/ !;
JI%MT/)"?P
和
JI%MT/
质 粒 分 别 与
940 !; UV(8
质粒共转染
&’()*
细胞&
01 Y
后倒置荧光显微镜
下观察细胞中绿色荧光蛋白的表 达 ! 以 观 察 转 染
效率&
*1 Y
后进行免疫印迹!检测存活蛋白的表达
水平!方法同上&
!"2
!伤口愈合"实验
将 转 染
JI%MT/)"?P
和
JI%MT/
的
&’()*
细
胞及对照组
&’()*
细胞接入
2
孔板! 细胞生长覆
盖率达到
69:
后! 用移液器枪头沿培养板底部呈
*
一 +字 形 划 痕 单 层 培 养 细 胞 !继 续 培 养 & 于
9 Y
’
13 Y
’
3X Y
和
*1 Y
时 在 倒 置 显 微 镜 下 测 量 细 胞 向
致伤区迁移的相对距离并照相& 根 据 原 始 细 胞 致
伤区距离计算出细胞实际迁移距 离 ! 每 组 设
/
个
孔!测量后取均数&
!"#
C
M
Y
K