乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一 ,其发病

率有逐渐增加的趋势 ,是引起妇女死亡的重要肿瘤
之一 。综合治疗是乳腺癌治疗的重要手段 ,多药耐
药现象 (MDR) 是乳腺癌临床化疗失败的主要原因 ,
克服 MDR 是目前肿瘤防治研究的热点 。目前已发
现的许多逆转多药耐药的药物 ,由于疗效不够理想 ,
毒副作用大 ,在临床上很难推广应用 。金克

2槐耳颗

粒为国家中药一类新药 ,具有化疗药的功效 ,良好的
促凋亡效果和免疫增强调节作用 ,能促进肺癌耐药
细胞株耐药性发生逆转 ,无毒副作用 。为验证槐耳
颗粒在无毒剂量时能否增强乳腺癌多药耐药细胞株

MCF

27ΠA 对阿霉素的敏感性及其逆转机制 ,我们对

40 例乳腺癌患者进行了临床观察 ,以期能找到逆转

MDR 效果好并且无毒副作用的逆转药物 ,发挥槐耳

颗粒在肿瘤综合治疗中的作用 ,进一步增强乳腺癌
的化疗效果 ,使患者早日康复 ,提高生存率 。

材料与方法

1. 设备及主要试剂 :金克

2槐耳颗粒由江苏启东

盖天力制药有限公司提供 ,MTT 为 Sigma 产品 ,ADM
为意大利 Farmitalia 公司产品 ,二甲基亚砜 (DMSO)
分析纯为天津市大茂化学仪器供应站提供 ,MDR

1

荧光定量 RT

2PCR 诊断试剂盒为中山大学达安基因

股份有限公司提供 ,RPMI

21640 为美国 Gibco BRL 公

司产品 ,胎牛血清购自中国医学科学院血液研究所 。
塑料培养瓶和培养板均为美国 Costar 公司产品 ,酶
标仪为 BioRAD 公司产品 450 型 ,荧光分光光度计

RF

2510 型为日本岛津产品 ,荧光定量 PCR 仪为美国

ABI 公司产品 。

2. 细胞株及细胞培养 :人乳腺癌细胞株 MCF

27Π

S 及相应的耐阿霉素细胞株 MCF

27ΠA 均由中国医学

科学院天津血液研究所提供 。在 37 ℃、

体积分数为

5 %的 CO

2

饱和湿度培养箱中 ,分别培养于含 10 %

血清 、

100 U

Πml 青霉素、100 μgΠml 链霉素的 RPMI2

1640 培养液中 ,3 d 传代一次 。MCF

27ΠA 细胞除上述

培养条件外 ,需加入 1. 0μg

Πml 的 ADM ,以维持细胞

的耐药性 。

3. 细胞毒性实验 :用胰酶消化细胞后 ,调整敏感

株和已经停加 ADM 两周的耐药株细胞浓度为 2 ×

10

5

Πml ,每孔 100μl 接种于 96 孔板中。实验设计 3

组 ,每组均设 3 个平行孔 ,实验组为槐耳颗粒组和

ADM 组 ,对照组为未加药的空白对照 ,实验组两组

均分别从第 1 孔到第 12 孔倍比稀释 ,每孔所加的药

物最终为 100μl 。将 96 孔板置于 37 ℃5 % CO

2

孵箱

中 ,培养 48 h 后 ,每孔加入 MTT 液 20 μl ,继续培养

4 h后 ,去掉上清液 , 每孔加入二甲基亚枫 (DMSO)

100μl ,用振荡器震荡 5 min ,室温放置数分钟 ,待紫
色颗粒完全溶解后 ,用全自动酶标仪测定每孔的

A

490nm

值 ,取三个平行孔的平均值 ,按公式计算细胞

抑制率 ( IR) : IR =〔1 - 实验组

A

均值

Π对照组

A

均

值〕×100 % ,并求出 IC

50

值 (半数细胞抑制剂量) 及

耐药倍数 (耐药细胞 IC

50

/ 敏感细胞 IC

50

) 。选择细胞

抑制率 < 15 %的药物浓度为该药的低毒剂量 ,选择
细胞抑制率 < 5 %的药物浓度为该药的无毒剂量 。

4. MTT 法测定耐药细胞对 ADM 的敏感性 :实验

方法同前 ,只是细胞均为耐药细胞 。实验设计分为

3 组 : ( 1) 倍 比 稀 释 ADM 组 ; ( 2) 无 毒 剂 量 槐 耳 颗
粒 + 倍比稀释 ADM 组 ; (3) 未加药的空白对照组 。
计算每组的 IC

50

值 ,求出逆转倍数 (未加逆转剂组的

IC

50

Π加逆转剂组的 IC

50

) 。

5. 荧光分光光度计测定细胞内 ADM 药物浓度 :

细胞处理同前 ,取对数生长期耐药细胞 2 ×10

5

Πml 。

实验组加无毒剂量槐耳颗粒 5. 0 ml + 不同浓度的

ADM(100 ,50 ,10 μg

Πml) ;对照组只加 ADM (100 ,50 ,

10μg

Πml) 。含 10 %胎牛血清的 1640 培养液 5 ml ,混

匀置孵箱中培养 ,将 ADM 及槐耳颗粒按要求加入培
养 3 h 。收集细胞 ,离心用 PBS 洗 3 次 ,重新悬浮于

0. 3 mol

ΠL HCl 的 50 % 乙 醇 消 化 液 中 消 化 过 夜

(4 ℃) ,离心沉淀 。据 ADM 本身发荧光的特点 ,取上

清液于荧光分光光度计上测定荧光强度 (激发波长

E

x

λ= 470 nm , 发 射 波 长 E

m

λ = 585 nm , 狭 缝 宽 10

nm) 。每个样品做 3 个平行管 ,同时做 ADM 浓度 -

荧光强度标准曲线 。

6. 荧光定量 PCR 法测定 MDR

1

基因表达水平 :

细胞培养同前 ,实验分四组 : (1) 敏感细胞 MCF

27ΠS

组 ; (2) 耐药细胞 MCF

27ΠA 组 (3) 耐药细胞 MCF27ΠA

加槐耳颗粒 1. 0 mg

Πml 组 (4) 耐药细胞 MCF27ΠA 加

槐耳颗粒 0. 01 mg

Πml 组。继续培养 10 h 后 ,用 PBS

洗 3 次 , - 80 ℃冻存 ,按荧光定量 RT

2PCR 试剂盒说

明的条件操作 ,测定各组 MDR

21 基因表达水平。

7. 统计学分析 :全部资料用 SPSS10. 0 软件进行

统计分析 ,计量资料用

gc

x

±

s

表示 ,各组及组间比较

用

t

或χ

2

检验 。

结 　　果

1. 槐耳颗粒对 MCF

27ΠS 和 MCF27ΠA 生长的影

・

3

1

5

・

中国肿瘤临床与康复

2004

年

12

月第

11

卷第

6

期 　

Chin J Clin Oncol Rehabil , December 2004 ,Vol 11 ,No. 6

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