谭金祥 !等

! "#$%&

沉默

’()*+

基因表达对人乳腺癌细胞生长和增殖的影响

",-.. /0123423/05 $6&

"/$6&

通过序列特异性的

降解作用" 能有效封闭靶

,$6&

和降低蛋白水平

笔者前期研究发现透明质酸酶 ’

78-.93:0/;-"2

’8-"2

(

高表达的人乳腺癌细胞"其生长)增殖)侵袭

转移能力较

’8-"2

低表达的强" 提示

’8-"2

与肿瘤

恶性潜能有关" 同时研究发现人乳腺癌

<=&><?>

@AB

)

<C&><D>EAFG

细胞株

’8-"2

呈高表达 "

H$>IF

和

H$>IF>AJ

细胞株

’8-"2

呈低表达

@ "A %

本研究

设计了以

’8-"2

基因

’(&*K

为靶标的

!/$6&

观

察其转染效率"分别检测其对

’8-"2

高表达的人乳

腺癌细胞株

<C&><D>LAB

<C&><D>EAFG

以及

’8-"2

低表达的人乳腺癌细胞株

H$>IF

)

H$>IF>AJ

’(&*B

基因

,$6&

的表达 ) 细胞增殖 ) 细胞周期

等影响,

材料与方法

!"!

材料

人乳腺癌细胞株

<C&><D>LAB

)

H$>IF

由上海

复旦大学肿瘤医院沈镇宙教授惠赠 -

<C&><D>

EAFG

)

H$>IF>AJ

购于中科院上海生物研究所细胞

库 ,

’(&*B>!/$6&

625-1/M2 N:013:. !/$6&

!>-N1/0

!/$6&

)

G/OP$Q

*/R/;

转染试剂及

!/$6&

荧光标记

试剂盒 ’

G/.20N23

!/$6& *-S2./05 T/1

购于美国

&,S/:0

公司- 总

$6&

提取试剂盒购于上海华舜公

司-

NC6&

合成及

OU$

扩增试剂购于

Q-V-$-

公司,

!"#

方法

KWXW+

!/$6&

的设计与合成

根据

Y20D-0T

’(&*+

基因已知序列’基因编号.

6<ZJJIA+X

按

!/$6&

序列设计原则"结合

&,S/:0

公司提供的网

上在线设计工具 " 选择

对

X+

个碱基的

!/$6&

在

Y20D-0T

表达序列标签 !

[GQ

(

数据库中用

D*&GQ

检索"确认所设计

!/$6&

序列的唯一性"如

未达到要求需重新设计

提交

&,S/:0

公司进行

筛选 + 优化 + 纯化 + 合成及退火的一对有效

!/$6&

干粉制剂 , 合成的

;"$6&>’(&*+

正义链序列为

F\>YYUU&]U&&YY&Y]&]&]Y11>A\

反义链序列

为

F\ >U&]&]&U]UU]]Y&]YYUU15>A\

K^+_ ‘K^AI

KWLWL

!/$6&

的标记

按

&,S/:0

公司

!/$6&

*-S2. V/1

试剂盒说明进行标记

!/$6&

KWLWA

细胞培养及转染

细胞株接种于含

Kab

小

牛血清的

$O<c>B^Ea

Y/SN: D$*

(

培养液" 置于

AId

体积分数为

的

培养箱中常规培养,

按

G/OP$Q

*/R/;

转染试剂盒操作说明优化转染

条件"分别将

’(&*B>!/$6&

025-1/M2 N:013:. !/$6&

!>-N1/0 !/$6&

以

Bee 0,:. f *

的终浓度加入细胞培

养液"孵育

LE‘Eg 7

后收获细胞进行检测, 每个实

验均重复

次,

BWLWE

C&Oc

细胞核染色

按

C&Oc

试剂说明书进

行细胞核染色后在荧光共聚焦显微镜下观察转染
效率"照相保存实验结果,

BWLWF

$Q>OU$

测定细胞株

’8-"2

基因的表达

(

细胞总

$6&

抽提及

NC6&

合成按试剂说

明书进行,

(

OU$

扩增,

OU$

反应体系的反应体积为

Fe ".

NC6& Be ".

引物浓度

Fe 0,:. f *

!"#

酶

]

’(&*B

基因

OU$

引物.正义链

F\>UQYYQYY&

&Y&Y&U&YY&&Y>A\

LBF‘LA^ SR

反义链

F\>YY

&YYU&Y&YUQY&Y&&U&Y>A\

F^F ‘FgE SR

扩增

产物片断为

AIe SR

反应条件.

_Ed F ,/0

_Ed

变

性

B ,/0

^Ad

退火

Ae "

ILd

延伸

B ,/0

共进行

个循环"最后

ILd

延伸

I ,/0

以

!>-N1/0 !/$6&

作阳性对照 " 其

OU$

引物 . 正义链

F\ >&UU

QQU&&U&UUUU&YUU&QYQ&UY>A\

反义链

F\>UQY

&QUU&U&QUQYUQYY&&YYQYY>A\

扩增产物片断

为

^_g SR

反应条件.

_Ed F ,/0

_Ed

变性

B ,/0

Fgd

退火

EF "

ILd

延伸

B ,/0

共进行

个循环"

最后

ILd

延伸

Be ,/0

(

结果判定, 实验分

组.实验组!

’(&*B>

!/$6&

阴性对照组 !

025-1/M2 N:013:.>!/$6&

(

和阳

性对照组!

!>-N1/0>!/$6&

每组实验重复

次, 取

F ". OU$

产物进行

BF 5 f *

琼脂糖凝胶电泳"紫外

照相并进行扫描分析"以

’(&*B

与

!>-N1/0

平均光

密度值的比值来半定量反映

’(&*B ,$6&

的表

达水平,

BWLW^

<QQ

法检测细胞增殖

!/$6&

转染按

&,S/:0

公司转染试剂盒说明书进行 "

!/$6&

终浓

度为

Bee 0,:. f *

Eg 7

后取出

孔板"离心"吸去

各孔中的培养液"换上无血清

$O<c>B^Ee

培养液"

每孔

Lee ".

并加入

<QQ

F ,5 f ,.

每孔加

继续孵育

E 7

后吸尽孔中的培养液"每孔

加

C<GP Lee ".

振荡器上振荡

Be ,/0

于自动酶

标仪

FIe 0,

处测定每孔的吸光度!

(

值, 按以下

公式计算细胞增殖的相对抑制效率, 增殖抑制率

对照组

值

实验组

值 (

对照组

值 %

Beeb

实验分

组.实验组!

’(&*B>!/$6&

阴性

对照组

无血清

$O<c>B^Ee

对照 (和阴性对照组

025-1/M2 N:013:.>!/$6&

每组实验重复

次,

"#$