龚

成，等

．

细胞外信号调节激酶

１／２

在瘦素促进子宫内膜癌

Ｉｓｈｉｋａｗａ

细胞增殖中的作用

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤

之一，其发病机制一直倍受关注。流行病学研究显
示，瘦素与子宫内膜癌的发生密切相关

［

１］

，

但其作

用机制迄今尚未明了。细胞外信号调节激酶
（

ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ

，

ＥＲＫ

）

是有丝

分裂原激活蛋白激酶（

ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ

，

ＭＡＰＫ

）

家族的一个亚族，参与细胞增殖、分

化等信号的转导，该信号转导通路的过度活化与肿
瘤的发生密切相关。

ＥＲＫ１

和

ＥＲＫ２

是

ＥＲＫ

的两个

重要成员，本研究探讨

ＥＲＫ１／２

信号转导通路在瘦

素促进子宫内膜癌细胞系

Ｉｓｈｉｋａｗａ

增殖中的作用。

１材料与方法

１．１

材料

人子宫内膜癌细胞系

Ｉｓｈｉｋａｗａ

购自美国

ＡＴＣＣ

公司。人瘦素购自

Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ

公司；培养基

ＤＭＥＭ

（

高糖）购自

Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ

公司；胎牛血清购自杭州四

季青公司；胰蛋白酶购自

Ｄｉｆｃｏ

公司；鼠抗人

ＥＲＫ１／

２

单克隆抗体、鼠抗人

ＥＲＫ１／２

磷酸化（

Ｔｈｒ２０２／

Ｔｙｒ２０４

）

单克隆抗体、鼠抗人

ＯＢ－Ｒｂ

多克隆抗体均

购自

Ｕｐｓｔａｔｅ

公司；

ＦＩＴＣ

标记羊抗鼠抗体（二抗）和

辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（二抗）购自博
士德公司；

ＥＲＫ１／２

激酶特异性抑制剂

ＰＤ９８０５９

购

自

Ｐｒｏｍｅｇａ

公司；

ＲＩＰＡ

细胞裂解液购自碧云天科技

公司；

ＭＴＴ

购自

Ｂｉｏｍｏｌ

公司；

ＢＣＡ

蛋白浓度测定试

剂盒和

ＥＣＬ

发光试剂购自

ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ

公司。

１．２

方法

１．２．１

细胞培养

Ｉｓｈｉｋａｗａ

细胞置于含

１０％

胎牛

血清的

ＤＭＥＭ

培养基中，于

３７℃

、

５％ＣＯ

２

培养箱

中培养，并消化、传代。

１．２．２

免疫荧光染色检测

ＯＢ－Ｒｂ

表达

将对数生

长期细胞接种于含盖玻片的

６

孔板内，培养

１２ｈ

。

待细胞充分贴壁后，取出盖玻片用冷甲醇固定

２０

ｍｉｎ

，

自然干燥

１０ｍｉｎ

，

然后用

０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳＴ

（

２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ

，

０．１５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ

，

０．０５％

Ｔｗｅｅｎ－２０

）

漂洗

５ｍｉｎ×３

次。

１∶

１０

稀释的兔血清

３７℃

封闭

３０ｍｉｎ

，

滴加鼠抗人

ＯＢ－Ｒｂ

一抗（

１∶

１００

），

４℃

过夜。

ＰＢＳＴ

漂洗

５ｍｉｎ×３

次，滴加

ＦＩＴＣ

标记的

羊抗鼠二抗（

１∶

１００

），

避光

３７℃

孵育

１ｈ

，

ＰＢＳＴ

洗

５

ｍｉｎ×３

次，加入甘油缓冲液封片保存，在荧光显微

镜下观察。以

ＰＢＳ

代替一抗作为阴性对照。

１．２．３

瘦素对

Ｉｓｈｉｋａｗａ

细胞增殖的影响

取对数

生长期细胞，制成单细胞悬液，按

５×１０

３

个细胞

／

孔

（

每孔

２００ μｌ

）

接种于

９６

孔板，贴壁生长后，换无血

清

ＤＭＥＭ

饥饿培养

２４ｈ

，

使细胞同步化。分别加入

含瘦素浓度为

０

、

１０

、

５０

、

１００

和

１５０ｎｇ／ｍｌ

的

ＤＭＥＭ

培养基（含

５％

胎牛血清），每个浓度设

１０

个平行

孔，其中无瘦素（

０ｎｇ／ｍｌ

）

组为对照组。继续培养

６

、

１２

、

２４ｈ

后，每孔加入浓度为

５ｍｇ／ｍｌ

的

ＭＴＴ２０

ｍｌ

，

继续培养

４ｈ

，

弃上清，每孔加入

１５０ μｌＤＭＳＯ

，

振荡

１０ｍｉｎ

，

用酶标仪测定

５７０ｎｍ

波长处每孔的

吸光度值（

Ａ

值），以不加细胞的空白孔调零。

１．２．４ＥＲＫ１／２

激酶抑制剂

ＰＤ９８０５９

对瘦素促细

胞增殖效应的影响

细胞处理同上，经血清饥饿培

养

２４ｈ

后，换含

５％

胎牛血清的

ＤＭＥＭ

培养基，分

别用以下方法处理：

①１００ｎｇ／ｍｌ

瘦素；

②１００ｎｇ／

ｍｌ

瘦素

＋２０ μｍｏｌ／ＬＰＤ９８０５９

；

③１００ｎｇ／ｍｌ

瘦素

＋

５０ μｍｏｌ／ＬＰＤ９８０５９

；

④１００ｎｇ／ｍｌ

瘦素

＋１００ μｍｏｌ／Ｌ

ＰＤ９８０５９

。用含

５％

胎牛血清的

ＤＭＥＭ

培养基作为

对照组，每组均设

６

个平行孔。分别在培养

６

、

１２

、

２４ｈ

后用

ＭＴＴ

法检测细胞增殖情况，相同实验重

复

３

次。计算细胞增殖率，细胞增殖率

＝

（

实验组平

均

Ａ

值

－

对照组平均

Ａ

值）

／

对照组平均

Ａ

值

×１００％

。

１．２．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ

检测

ＥＲＫ１／２

的活化

取对数

生长期细胞，制成单细胞悬液，按

１×１０

６

个细胞

／

孔

接种于

６

孔板，贴壁生长后，加入

１００ｎｇ／ｍｌ

瘦素，

于

３７℃

、

５％ＣＯ

２

培养箱分别孵育

２０

、

４０

、

６０ｍｉｎ

，

每

组设

６

个平行孔。根据

ＲＩＰＡ

试剂盒说明书提取细

胞内总蛋白，

ＢＣＡ

法检测蛋白浓度。取

５０ !ｇ

蛋白

样品进行电泳，转膜，封闭，加入鼠抗人

ＥＲＫ１／２

磷

酸化一抗（

１∶

１０００

）

４℃

孵育过夜，洗涤后加辣根过

氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（

１∶

５００

），

３７℃

孵育

２

ｈ

，

充分洗涤后加入

ＥＣＬ

发光试剂，在

Ｘ

线胶片上

曝光，显影。再次洗膜，封闭，加入鼠抗人

ＥＲＫ１／２

一抗（

１∶

１０００

）

行第二次免疫印迹，方法同前，洗片

并将图像扫描后应用

ＢａｎｄＳｃａｎ５．０

（

Ｇｌｙｋｏ

公司）检

测各条带

Ａ

值，以

ｐ－ＥＲＫ１／２

和

ＥＲＫ１／２

的比值表

示

ＥＲＫ１／２

的活化程度。

值

＝０．７３±０．０２

），

１００ｎｇ／ｍｌ

组与

１５０ｎｇ／ｍｌ

组差异无统计学意

义（

Ｐ＝０．１２９

）；

ＰＤ９８０５９

能明显抑制瘦素对

Ｉｓｈｉｋａｗａ

细胞的增

殖作用，

１００ｎｇ／ｍｌ

瘦素和

１００ μｍｏｌ／ＬＰＤ９８０５９

作用

２４ｈ

后，细胞增殖率为（

６．８８±０．８６

）

％

；

Ｉｓｈｉｋａｗａ

细胞经

１００ｎｇ／ｍｌ

瘦素处理后，

ＥＲＫ１／２

活化程度明显增高。结论：瘦素可能通

过激活

ＥＲＫ１／２

信号转导途径促进子宫内膜癌细胞的增殖。

关键词：子宫肿瘤；瘦素；信号调节激酶；

Ｉｓｈｉｋａｗａ

细胞；

增殖

中图分类号：

Ｒ７３７．３３

文献标识码：

Ａ

文章编号：

１０００－４６７Ｘ

（

２００７

）

１１－１２１１－０４

１２１２