1． 4
样品的测定
1． 4． 1
测定原理
［6］
采用以 H
2
O
2
-Fe
2 +
体系产生
羟基自由基，其反应机理如下：
Fe
2 +
+ H
2
O
2
→Fe
3 +
+ OH
－
+·OH
Fe
3 +
+ H
2
O
2
→Fe
2 +
+·O
－
2
+ 2H
+
·OH + Fe
2 +
→Fe
3 +
+ OH
－
·O
－
2
+ Fe
3 +
→Fe
2 +
+ O
2
净反应： H
2
O
2
Fe
→
2 +
2H
2
O + O
2
上述体系产生的羟自由基可以与罗丹明 B 发
生作用，使显色剂的吸光度降低为 A
0
，11 种中药的
水提取物可以清除溶液中的·OH，这样加入水提物
后会使溶液吸光度降低程度变小为 A
S
，若显色剂罗
丹明 B 的吸光度为 A，则中药对羟基自由基的清除
率 D 可按下面公式计算：
D =
（ A
S
－ A
0
） /（ A － A
0
） × 100%
D
值大小即可评价中药水提物抗氧化活性。
1． 4． 2
样品抗氧化活性的测定
在一系列 10 mL
带盖比色管中，分 别 加 入 1． 4 mL 罗 丹 明 B 溶 液
（ 2 ×10
－4
mol / L
） 、
1． 0 mL Fe
2 +
溶液（ 5 × 10
－3
mol / L
） ，
1． 0 mL
抗氧化剂溶液、
1． 0 mL H
2
O
2
（ 2 ×10
－ 2
mol / L
） 溶
液，2． 0 mL 邻苯二甲酸氢钾-HCl 溶液（ pH 2． 52） ，
用一次蒸馏水稀释到 10 mL，并摇匀，放置 5 min 后，
在波长 554 nm 处测定吸光度。
2
结果与讨论
2． 1
测定波长的选择
在最佳实验条件下测定下列体系： ①罗丹明 B
溶液和② 罗丹明 B-Fe
2 +
-H
2
O
2
溶液的可见吸收光
谱，两 个 体 系 得 到 的 谱 图 其 最 大 吸 收 波 长 均 在
550 nm
附近，但体系②的吸光度值较①体系下降，
由此可以说明这种吸光度的下降是由于体系②产生
的羟自由基与显色剂罗丹明 B 作用的结果。据此
选择最佳检测波长为 550 nm。
2． 2
酸度的选择
分别配 制 pH 为 2． 0 ～ 6． 0 范 围 的 RB-Fe
2 +
-
H
2
O
2
溶液，并在最佳波长处检测体系的 ΔA，发现在
pH 2． 4
时，体系 ΔA 有最大值。因此，测定时控制
pH
为 2． 4。
2． 3
邻苯二甲酸氢钾-HCl 溶液用量的选择
考察了 0． 4 ～ 4． 0 mL 的邻苯二甲酸氢钾-HCl
缓冲溶液的用量对吸光度的影响，结果表明，随着用
量增大，吸光度逐渐上升，达到 2． 0 mL 后，其吸光度
基本保持不变。故选用缓冲溶液体积为 2． 0 mL。
2． 4
Fe
2 +
的用量选择
其它条件不变，加入不同体积 Fe
2 +
溶液，发现
随着 Fe
2 +
体积的增加，ΔA 值也增大，但加入 Fe
2 +
为
1． 0 mL
时，ΔA 的值趋于稳定。故本实验 Fe
2 +
溶液
用量为 1． 0 mL。
2． 5
H
2
O
2
用量的选择
在罗丹明 B 溶液浓度为 1． 6 × 10
－ 5
mol / L
，Fe
2 +
溶液浓度为 5 × 10
－ 4
mol / L
，pH 控制为 2． 4 时，考察
H
2
O
2
用 量 对 吸 光 度 的 影 响。结 果 表 明，当 加 入
H
2
O
2
＞ 1． 0 mL
，随着 H
2
O
2
用量的增加，ΔA 值变化
不大。故本实验采用 2 × 10
－ 2
mol / L H
2
O
2
溶液用
量为 1． 0 mL。
2． 6
罗丹明 B 用量的选择
其它条件不变，体系 pH 控制为 2． 4 的情况下，
加入不同体积的罗丹明 B。实验结果表明，随着罗
丹明 B 用量增加，ΔA 值也增大。当罗丹明 B 溶液
体积为 1． 5 mL 时，ΔA 变化趋势渐渐平缓。故选择
罗丹明 B 用量为 1． 5 mL。
2． 7
试剂加入顺序实验
由于羟自由基存在时间短，因此试剂的加入先
后顺序对测定有影响。本方法是利用罗丹明 B 显
色法测定羟自由基，就必须保证体系产生的羟自由
基能与罗丹明 B 充分反应，因此罗丹明 B 应在羟自
由基产生之前加入到溶液中，并且摇匀，最后再加入
H
2
O
2
。
2． 8
中药的抗氧化活性的测定
在以上选择好的最佳条件下，对处理好的 11 种
中药水提物清除羟基自由基的能力进行检测，结果
见表 1。
表 1 中药提取液对羟自由基的清除率（ n = 5 ）
Table 1
Hydraxyl radical scavenging rate of Chinese extract
样品
清除率 /%
五倍子
65． 8
（ 600）
枸杞
67． 8
（ 40）
红枣
64． 6
（ 40）
诃子
57． 4
（ 40）
何首乌
60． 3
（ 20）
当归
48． 5
（ 20）
黄芩
38． 2
（ 10）
茜草
37． 9
（ 10）
五味子
36． 1
（ 10）
生地
20． 9
（ 10）
决明子
15． 4
（ 10）
注： 括号内为试液稀释倍数。
3
结论
以罗丹明 B 为显色剂通过测定羟基自由基的
变化，来评价中药水提物抗氧化活性，通过实验确定
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