土壤微生物是活性天然产物的重要来源，微生物代谢产物具有极大的化学结构多样性
和复杂性，目前已经发现的具有生物活性的微生物次生代谢产物达２０

 ０００多个［１］。

代谢产物的多样性一方面决定于菌株本身的生产能力，另一方面还取决于能够允许它们产
生的发酵条件，特别是发酵培养基组成和培养条件［２，３］。如在对大环内酯类抗生素生
物合成途径的研究中发现，微生物发酵过程中产生的ＮＨ４＋及ＰＯ４３－会抑制抗生素
的产生。Ｏｍｕｒａ［４，５］利用磷酸镁捕获ＮＨ４＋、用水铝英石捕获ＰＯ４３－，成
功开发了几种新的生物活性物质。尽管微生物的物种多样性决定了其代谢产物的化学结构多
样性，但要尽可能体现此种多样性的传递，必须根据不同产生菌的生理生化特性设计多种
不同的发酵培养条件［６］。因此为了保证一个菌株所产生的次生代谢产物的多样性及产量，
有必要采取多种培养基及培养条件［７］。以放线菌ＷＳ－２２０１１为研究对象，通过研
究摇瓶发酵和发酵罐发酵两种不同的发酵方式下ＷＳ－２２０１１产生的次生代谢产物多
样性及产量随时间变化的动态趋势，确定ＷＳ－２２０１１最佳的发酵方式及兼顾代谢产
物多样性、产量的最佳发酵时间，在此基础上对ＷＳ－２２０１１发酵提取液进行次生代谢
产物的分离制备，通过ＬＣ－ＭＳ分析确定其化合物结构和活性。

 

　　１

 材料与方法 

　　１．１

 材料 

　　１．１．１

 培养基 种子培养基：甘露醇 ２０ ｇ，蛋白胨１０ ｇ，豆油 ０．５ ｇ，

ＫＨ２ＰＯ４

 ０．３５ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ ７．０～７．２。 

　　１．１．２

 主要仪器 Ｗａｔｅｒ ２６９５高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ ９９６二

级管阵列检测器，色谱工作站Ｍａｓｓｌｙｎｘ

 Ｖ４．０）；高效制备液相色谱仪（Ｗａ

ｔｅｒｓ

 ２５２５泵，带２７６７自动收集系统，２９９６二级管阵列检测器，色谱工作

站Ｍａｓｓｌｙｎｘ

 Ｖ４．０）；高效液相色谱－质谱联用仪：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高

效液相色谱系统，美国Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ

 Ｑｕａｔｔｒｏ M ｉｃｒｏ?

�质谱仪［电喷

雾离子源（ＥＳＩ）］，Ｍａｓｓｌｙｎｘ

 Ｖ４．１液质联用分析软件。 

　　１．１．３

 主要试剂 甲醇（色谱纯，德国ＣＮＷ），乙腈（色谱纯，德国ＣＮＷ），

去离子水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。液质联用分析所用的高纯氮气购自武汉汉阳钢厂，纯度
为９９．９９９％。

 

　　

1.1.4 菌株 放线菌菌种ＷＳ－２２０１１由湖北省农业科学院生物农药工程研究中心提

供。

 

　　１．２

 方法 

　　１．２．１

 种子培养 用无菌接种环从斜面中取少量孢子或菌丝转入种子培养基中，在

旋转式摇床上２８

 

℃、１３０～１４０ ｒ／ｍｉｎ培养９６ ｈ。每次每菌株准备１０瓶。移

种前，对每瓶种子取样镜检，以排除有污染的摇瓶。

 

　　１．２．２

 摇瓶发酵 待种子培养好时，转入５００ ｍＬ锥形瓶中（装样１００ ｍ

Ｌ），接种后的锥形瓶置于旋转式摇床上２８

 

℃、１３０～１４０ ｒ／ｍｉｎ培养５ ｄ。 

　　１．２．３

 发酵罐发酵 

　　１）种子准备。２０

 Ｌ发酵罐培养基投料体积为１２ Ｌ。准确称取各种培养基成分，用

去离子水溶解，然后转入发酵罐中，加入适量聚醚消泡剂（０．１％，Ｖ／Ｖ），用１

 ｍ

ｏｌ

/L 氢氧化钠调节ｐＨ ７．０～７．２，在１２１ 

℃蒸汽灭菌２５～３０ ｍｉｎ，自

来水冷却至２８

 

℃。打开进气阀，空气通过过滤器除菌后进入罐体，维持罐压０．０３～

０．０５

 ＭＰａ。