宁夏医科大学学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
第
３４ 卷 ２ 期
２０１２ 年 ２ 月
１．
３
流动相
Ａ 液的配制 ０．０１８ｍｏｌ・ Ｌ
－１
磷酸二氢钠 ＋
０畅
００１
ｍｏｌ・ Ｌ
－１
ＥＤＴＡ， 用 ２０％ 硝 酸 调 至 ｐＨ ＝２．５， 经
０畅
４５μ
ｍ 双层水系滤膜过滤。
１．
４
流动相
Ｂ 液的配制 ０．０１８ ｍｏｌ・ Ｌ
－１
磷酸二氢钠，用
２０％
硝酸调至
ｐＨ ＝２．５，经 ０．４５μｍ 双层水系滤膜过滤。
１．
５
高效液相色谱分析条件 流动相
Ａ 液为（０．０１８ｍｏｌ・
Ｌ
－１
磷酸二氢钠 ＋０．００１
ｍｏｌ・ Ｌ
－１
ＥＤＴＡ）：甲醇 ＝６０∶５０（Ｖ／
Ｖ，ｐＨ ＝２．５），流速为 １．０ｍＬ・ ｍｉｎ
－１
，
检测波长为 ２７０
ｎｍ，
柱温为 ２１℃，进样量为 ２０μ
Ｌ，梯度淋洗，０ ～１０ｍｉｎ 时，流动
相
Ａ 液∶甲醇体积比为６０∶５０，到 １５ ｍｉｎ 时变为流动相 Ｂ
液，持续 １０
ｍｉｎ 后，再恢复流动相 Ａ 液：甲醇体积比为 ６０
∶
５０。
１．
６
戴安
ＡＳＥ２００ 快速溶剂萃取仪萃分析条件 系统压
力：１０００
ｐｓｉ；加热炉温度：１０５℃；炉加热时间：１０ｍｉｎ；静态萃
取时间：５
ｍｉｎ；新溶剂量：５０ｍＬ，６０％冲洗；吹扫时间：３０ｓ；静
态萃取次数：２ 次；溶剂：１５％硫酸锌溶液。
１．
７
标准曲线的制作 用流动相
Ａ 液稀释制备含四环素、
氯霉素的标准溶液，四环素浓度在 ０．１０ ～８．００μ
ｇ・ ｍＬ
－１
之
间，氯霉素浓度在 ０．２ ～１２μ
ｇ・ ｍＬ
－１
，
进样量 ２０μ
Ｌ，测量保
留时间及峰面积，每种浓度重复 ６ 次，用峰面积对浓度求回
归方程式，氯霉素
Ｙ ＝４３．６４２５ｘ ＋０．１１２４，ｒ ＝０．９９９８， 四环
素
Ｙ ＝４２．８３４５ｘ ＋１．１２３１，ｒ ＝０．９９９８。
１．
８
样品前处理 准称取样品 １．０
ｇ，加 １０．０ｇ 硅藻土，研
磨成沙状，放入事先在底部装有 １０．０
ｇ 的氟罗里硅土萃取
池中，以下按 １．６ 的方法操作进行萃取，后将萃取液倒入
Ｋ －Ｄ浓缩器浓缩至约 １ｍＬ，移入 ２ｍＬ 定量瓶中，用 １５％硫
酸锌溶液定容至 ２
ｍＬ，经 ０．４５μｍ 双层水系滤膜过滤，待分
析测定。
１．
９
样品的测定 把处理好的样液放入
Ｇ１３１３Ａ ＡＬＳ 自
动进样器中进行
ＨＰＬＣ 分析，记录 ２ 种抗生素的峰面积，根
据 ２ 种抗生素的保留时间定性，峰面积和标准曲线定量。
２
结果
２．
１
波长的选择 在仪器上根据 ２ 种抗生素的紫外吸收
光谱图可见，四环素在 ２７０、３５５
ｎｍ 处各有一个吸收峰，氯霉
素在 ２７８
ｎｍ 处有一个吸收峰，分别在波长 ２７０、２７８ 和 ３５５
ｎｍ 处以 ２ 种抗生素的混合标准液进行测定。 结果表明，在
波长 ２７０
ｎｍ 处，２ 种抗生素色谱峰分离较好且灵敏度高，故
选择测定波长为 ２７０
ｎｍ。
２．
２
流动相的选择
２．
２．
１
流动相比例的选择 为了有利于色谱峰的分离，选
用 ０．０１８
ｍｏｌ・ Ｌ
－１
磷酸二氢钠溶液与甲醇的混合液为流动
相。 分别进行
Ｖ
磷酸二氢钠
∶
Ｖ
甲醇
＝８０∶
４０、７０∶
４５、６０∶
５０、５０∶
５５
的试验。 由仪器显示色谱图可见，随着流动相中甲醇含量
的增加，２ 种抗生素测定的灵敏度升高，保留时间减少。 但
色谱峰分离变差。 考虑到分离度和保留时间，本方法选用
Ｖ
磷酸二氢钠
∶
Ｖ
甲醇
，６０∶
５０
为流动相。
２．
２．
２
流动相的选择优化 流动相中加入
ＥＤＴＡ 是为了
提高方法的精密度，使分离效果更好，因为四环素类抗生素
分子中含有酚羟基和烯醇基，易与二价金属结合，造成重现
性差，流动相中加入适量
ＥＤＴＡ 可以改善这种现象，经比较
实验，加入 ０．００１
ｍｏｌ・ Ｌ
－１
ＥＤＴＡ 对方法的精密度起到了
稳定的作用。
２．
３
硫酸锌浓度的选择 用样品分别做浓度为 ５．０％、
１０畅
０％、１５％
和 ２０％硫酸锌溶液的萃取试验，观察蛋白质沉
淀率及对测定结果的影响，随着硫酸锌浓度的增大，样品中
的蛋白质沉淀更加完全，有利于萃取液的过滤，结果表明：
１５％，２０％
时蛋白质沉淀最完全，峰面积一致，故选 １５％。
２．
４
样品处理萃取液的选择 用硫酸锌溶液作为萃取液
是因为 ２ 种抗生素都能够溶解于水，硫酸锌溶液可沉淀营
养面霜中的蛋白质，起到萃取、净化的作用，无需再进行液
样微净化，可直接进样测定。
２．
５
静态萃取次数的选择 选 １、２、３ 次，萃取 １ 次，萃取
率低，峰面积低，萃取 ２、３ 次峰面积基本一致，故选萃取
２
次。
２．
６
静态萃取时间的选择 选 １、２、５、６、８
ｍｉｎ、观察峰面
积及萃取率的变化，结果表明 ５、６、８
ｍｉｎ，峰面积基本一致，
１、２、３
ｍｉｎ、峰面积偏低，故选 ５ｍｉｎ。
２．
７
方法的回收率和精密度 以空白面霜样品为本底，分
别加入不同量的四环素、氯霉素，每个样品平行测定 ６ 次，
见表 １。
表 １ 抗生素的回收率和标准偏差（
ｎ ＝６）
抗生素
加入量 ／
μ
ｇ・ ｍＬ
－１
测得值／
μ
ｇ・ ｍＬ
－１
回收率 ／
％
ＲＳＤ／
％
四环素
１
．
．
０
０
．
９８
９８
Ｓ
１
殚
．
１５
４
．
．
０
４
．
０５
１０１
Ｓ
１
殚
．
４５
８
．
．
０
８
．
０６
１００
Ｓ
０
殚
．
３５
氯霉素
２
．
．
０
２
．
０１
１００
Ｓ
．
５
１
殚
．
０４
４
．
．
０
４
．
０６
１０１
Ｓ
．
５
０
殚
．
９６
１０
．
．
０
１０
．
０４
１０４
Ｓ
０
殚
．
６５
２．
８
方法的线性范围和检出限 四环素浓度在 ０．１０ ～
８畅
００μ
ｇ・ ｍＬ
－１
之间，氯霉素浓度在 ０．２ ～１２μ
ｇ・ ｍＬ
－１
，
具
有良好的线性关系，相关系数
ｒ 值为 ０．９９９８。 四环素最低
检出限为 ０．２７
ｍｇ・ ｋｇ
－１
，
氯霉素最低检出限为 ０．１５
ｍｇ・
ｋｇ
－１
。
以
Ｓ／Ｎ ＞３ 计算四环素定量下限为 ０．３８ｍｇ・ ｋｇ
－１
，
氯霉素定量下限为 ０．１９
ｍｇ・ ｋｇ
－１
（
样品以 １．０
ｇ 计）。
２．
９
实际样品的测定 对市售 １０ 种品牌 ６５ 个营养面霜
样品进行检测，样品中检出 ３４ 份含四环素，含量为 １．０ ～
１３４６
ｍｇ・ ｋｇ
－１
，１
份含氯霉素和四环素， 氯霉素含量为 １２６
ｍｇ・ ｋｇ
－１
，
四环素含量为 ３２７
ｍｇ・ ｋｇ
－１
。
３
小结
目前，市售的化妆品中有加抗生素的现象发生，尤其是
加四环素和氯霉素类药物居多，对人体的健康构成潜在的
危害
［５］
，
长期接触四环素、氯霉素会在身体内富集，对胃、
肠、肝脏及牙齿等均有副作用，还会造成过敏反应，二度感
染，致畸胎等，而氯霉素有更严重的副作用，它能抑制人体
骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症
等疾病。 因此，对化妆品中抗生素的检测刻不容缓，本方法
各项指标均符合方法学的要求，且快速简便，尤其适合抽检
・
２
９
１
・