!" # 菌株生态学与生理生化特征

依据文献［!$%!&］对筛选出的菌株进行形态和

生理生化特征鉴定。

!" #" ! 革兰氏染色法’ 首先在超净工作台内挑取单

菌落到加有少量生理盐水的载玻片上，自然风干；再

滴加少量结晶紫染料初染 ! ()* 之后用流水冲洗；
然后加入少量碘液放置 ! ()* 之后用流水冲洗；再
加少量 +$, 乙醇，脱色 -. / 之后用流水冲洗；最后
加入番红复染 ! ()*，用清水冲洗后，镜检。

!" #" 0 接触酶实验’ 将接种培养 0# 1 的斜面菌种以

接种环取一小环涂抹于已滴有 -, 2

的玻片上，

如有气泡产生，则为阳性，反之为阴性。

!" #" - 碳源和氮源利用实验’ 从平板中挑取单菌落

进行液体培养 !4 5 0# 1，以菌悬液接种连续 - 代移
种于灭了菌的碳源利用培养液，浑浊为阳性，反之为

阴性；将培养 !4 5 0# 1 的菌液接种到氮源利用培养
液中，适温培养 - 5 6 7，与空白试管对比，较浑浊为
阳性，反之为阴性。

!" #" # 耐盐性实验 ’ 将幼龄菌株接种在 0, 、$, 、

6, 和 !., 的不同浓度 89:; 的 <= 培养基中，适温

培养 - 5 6 7，与未接种的试管对比，自测生长情况。

!" $ 菌株分子生物学鉴定

!" $" ! 菌株总 >8? 提取’ 从超低温冰箱中取出保

存的上述甘油菌液，先划线培养出单菌落，然后挑取

单菌落进行摇瓶培养 -6 @ 过夜。以 $ ... A・()*

B !

离心 - ()*，收集菌沉淀，准备提取总 >8?。应用淤
泥基因组 >8? 快速提取试剂盒（离心柱型，购于北
京百泰克生物技术有限公司）并按照该试剂盒介绍

的操作步骤提取菌液总 >8?。

!" $" 0 对提取的 >8? 序列 C:D 扩增’ 通过 EA)(FA

EAF()FA $" . 软件设计 !&G A>8? 上、下游引物，其中
上游引物为 $H%I?I ?IJ JJI ?J: :JI I:J :?I%

-H；

下游引物为 $H%??I I?I IJI ?J: :?I ::I

:?%-H；

对菌液总 >8? 序列进行 C:D 扩增。C:D 反

应体系为：

!. K <? J9L MNOOFA ." $ !<，78JC # !<，模

板 >8? ." $ !<，上游引物 ! !<，下游引物 ! !<，
772

3 -4 !<，<? J9L ." $ !<，共 $. !<。C:D 反应

条件为：

+# @ 预变性 $ ()*，+# @ 变性 #$ /，退火

$$ @ ，

#$ /，60 @ 延伸 +. /，共 0$ 个循环，之后

60 @ ，

!. ()*，

# @ 保存。C:D 产物用 0, 琼脂糖凝

胶电泳检测。

!" $" - 对 C:D 产物测序’ 将 C:D 产物送往基因公

司测序，并在 IF*M9*P 数据库里进行比对，找出被筛
菌种属等。

0 结果

0" ! 菌株形态学鉴定

经鉴定该菌为革兰氏阴性菌，

细胞卵圆形或杆状，

单个或短链状排列。菌落呈橘红色或橘黄色，表面湿

润，

不透明。细胞表面产生粘液或生有荚膜。经芽孢

染色证明此菌株不产芽孢，

接触酶实验呈阳性结果。

0" 0 菌株生理生化鉴定

对该菌株进一步进行生理生化鉴定，根据文献

［!$］所述该菌株跟类球红细菌属 !"#$#%&’()* +,- 特点

相似。在碳源利用率试验中，

不加碳源的不生长，

加葡

萄糖为唯一碳源比用乙酸钠为唯一碳源的生长状态要

好。在氮源利用率实验上，空白不生长，加 82

比加 Q83

生长的状态差。在耐盐性试验中，

该菌株对

89:; 的耐受性浓度依次为：

6, R $, R 0, R 空白，

在

!., 的 89:; 浓度下该菌不生长

（表 !）。

表 !’ 能量利用实验结果和耐盐性实验

实验项目

菌株反应

空白

碳源利用实验

葡萄糖

S S S

乙酸钠

S S

空白

氮源利用实验

S S

Q83

S S S

空白

S S S S

0, 89:;

S S S

耐盐性实验

$, 89:;

S S

6, 89:;

!., 89:;

’ ’ 注：

“ S ”表示阳性反应，

“ S ”越多说明反应越强；

“ B ”表示阴性结

果。

0" - !&G A>8? 的基因序列分析

以菌株总 >8? 为模板，利用设计的上、下游引

物进行 !&G A>8? 扩增，电泳结果证实约在 ! $.. ME
处有清晰可见明亮的单条带（图 !）。

注：T 为 >8? (9APFA；! 为 C:D 扩增产物

图 !’ !&G A>8? 序列 C:D 扩增产物电泳图

重庆师范大学学报（自然科学版）’ 1UUE：V V WWW" XL*NY" X*’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ ’ 第 0+ 卷