1：2：1 样品预处理

将 8mL 污泥混合液加入至 10mL 灭菌离心管中，在 3000×g 下离心 4min，弃去上清液。

用灭菌蒸馏水清洗一次，同样的条件下离心 4min，弃去上清液。得到的污泥样品可用于 DNA

的提取。

1：2：2 基因组 DNA 的提取

基因组 DNA 的提取采用化学裂解-酚\氯仿\异戊醇抽提-试剂盒纯化的方法，具体步骤见

参考文献[9]。

1：3 氨氧化菌的 NestedPCR 扩增

氨氧化菌的 NestedPCR 扩增技术需经过 2 轮的 PCR 扩增，第 1 轮以总 DNA 为模板使用氨

氧化菌的特定目标引物和相应的 PCR 反应程序对氨氧化菌进行针对性扩增;第 2 轮以第 1 轮

PCR 扩增产物为模板用通用引物 F357-GC 和 R518 与 PCR 反应程序进行扩增。氨氧化菌的特

异性引物对为上游引物是将 CTO189fA/B 与 CTO189fC 以 2∶1 的摩尔比混合，下游引物为

CTO654r[11]。第 1 轮 PCR 反应体系为 25μL 的 2×TaqPCRMasterMix，1μL 的上游引物，1

μL 的下游引物，1μL 的模板，然后用无菌超纯水补足至 50μL。第 1 轮 PCR 反应体系同上，

同时做空白对照。

扩增后 PCR 产物经琼脂糖电泳检测片段大小约为 250bp，表明 PCR 扩增成功，可进行后

续 DGGE 电泳分析。

1：4 氨氧化菌 16SrDNA 片段的 DGGE 分析

实验采用 C：B：S： SCIENTIFIC 公司 DGGE-2001 系统对 PCR 产物进行变性梯度凝胶电

泳分离，完毕后将凝胶进行硝酸银染色，碳酸钠显影，并将图像在观测仪中进行拍照存档。

1：5 目的条带的克隆与测序

选取 DGGE 上明显的条带用灭菌刀切取并置于 1：5mL 的灭菌离心管中，加入 50μL 已灭

菌的超纯水，在 60~100℃下水浴 20min;取出离心管置于 4℃冰箱中静置过夜，待 DNA 片段

从胶中缓慢浸出。将离心管在 5000r/min 下离心 5min，取 6μL 浸出液为模板进行 PCR 扩增。

将 PCR 扩增产物置于 1：5% 琼脂糖凝胶中检测，若电泳结果较好，则将 PCR 产物送至

天津华大基因技术有限公司进行 DNA 常规测序。

1：6 DGGE 图谱的生物多样性及相似性分析