图
2. 二步发酵法发酵路线
本文将以
D-葡萄糖为开端，重点介绍二步发酵生产维生素 C 的过程，其中包括菌种的培育、菌种
的保藏、种子的制备、发酵动力学、发酵环节的控制和染菌及防治等方面的内容。
2 菌种的培育
二步发酵生产维生素
C 过程中用到的菌系为混合菌系
[23]
，包含的发酵菌种类很多，这里将主要介
绍巨大芽孢杆菌菌种的培育。（由于生黑醋杆菌的相关资料查不到，这里就不进行论述了，可以考虑从
相关机构或科研院所直接获取现成的生黑醋酸杆菌，这也是获取菌种的一种方法）。
2.1 菌种特性
巨大芽孢杆菌：杆状，末端圆；单个或呈短链排列，
1.2～1.5×2.0～4.0 微米；能运动；芽孢
1.0～1.2×1.5～2.0 微米，椭圆形，中生或次端生；能够液化明胶慢、胨化牛奶、水解淀粉、不还原硝
酸；巨大芽孢杆菌为产孢杆菌，且为革兰氏阳性菌及
，也为常见的油中腐生菌。
2.2 菌种的分离
从巨大芽孢杆菌的特性分析，可以从腐败的食用油中分离巨大芽孢杆菌。具体方法是取适量腐败食
用油，将其放入适合巨大芽孢杆菌生长的培养液中剧烈震荡，使其中的细菌大量进入到培养液中稀释
溶液到适当的倍数，在合适的培养基上涂布、培养，长出纯的的单菌落，对单菌落中细菌进行分析，确
定巨大芽孢杆菌。分离培养基成分（
%
）：酵母膏
0.3
、牛肉膏
0.3
、玉米浆
0.3
、蛋白胨
1.0、KH2PO4
0.1 、 MgSO4 0.04
、 尿 素
0.1 、 CaCO3 0.1
、 山 梨 糖
2.0
、 琼 脂
2.3 、 10ppm FeSO4
0.1mL/L 、pH=607~7.0
[2]
。
2.3 菌种的检验
接下来进行的步骤就是对纯菌落中的细菌进行检验，确定巨大芽孢杆菌。进行该步骤在目前比较先
进的方法是多重
PCR 技术检测。其基本方法是挑取培养基上单个菌落, 接种于营养肉汤液体，30℃快
速振摇培养
16h，, 离心取沉淀, 采用硅藻土吸附法快速提取各菌株的基因组 DNA,
作为
PCR 的模板
[3]
。然后对所获取的
DNA 利用 PCR（聚合酶链式反应）进行扩增，获取足够量的 DNA，以便进行测序。
测序工作可送到专门服务公司进行，如海生工生物工程技术服务有限公司。
若要对菌种的形状加以改良，提高效率或增强环境适应能力等，可通过诱变育种、杂交育种、基因
工程育种或人工选择等方法进行，如通过基因工程育种获得了能够生产胰岛素的菌种，利用射线照射、
太空失重育种等。由于本文未涉及菌种改良就不详细叙述菌种改良这一方面的内容。
3
说明：
目前生
产中假
单孢杆
菌已被