℃、100 r/min 下培养 1 h。浓缩培养液，将其均匀涂布于含 100 μg/mL 亮氨酸的 YPD 平板

上，

℃避光下培养，得到转化子。再从酵母转化子中提取质粒 DNA，转化入 E. coli DH5α

感受态细胞中，抽提质粒

DNA 并进行双酶切鉴定。

2 结果与分析

2.1 ARS305 侧翼序列的扩增

PCR 产物经 0.8%的琼脂糖凝胶电泳后发现，所扩增片段分别为 1 200、1 700、2 300 bp，

与预期大小相符（图

1）。

2.2 酵母自主复制质粒的构建及检测

　　酵母整合型质粒

pRS405 可以在大肠杆菌中复制，氨苄青霉素抗性基因可作为筛选标记。

但它不能在酵母中复制，只有通过重组到酵母染色体上才能随染色体的复制而复制。

pRS405

带有

LEU 基因可作为在酵母 LEU 基因缺失株中的筛选标记。将扩增的目的片段插入到酶切

的

pRS405 载体中以检测 ARS305 侧翼序列自主复制活性。挑取单菌落，接种于氨苄抗性液

体培养基，

℃过夜培养，碱裂解法提取质粒。经 BamHⅠ 和 XhoⅠ 双酶切鉴定，电泳结果与

预期大小相符（图

2），表明成功构建了自我复制型载体 PA500、PA1000、PA2000。

2.3 ARS 功能质粒丢失率的测定

　　酵母转化效率是鉴定自主复制活性强弱的直接指标。将质粒

PA500、PA1000、PA2000 定量

转化酵母。结果表明，尽管这些片段均有

ARS 活性，但酵母转化效率存在一定差异，且质粒

PA1000 比 PA2000 有更高的转化频率。

　　由于含有

ARS 片段的质粒在酵母细胞内独立复制，并非整合到酵母染色体上，所以在

细胞分裂过程中，就存在质粒丢失问题。将含有质粒

PA500、PA1000、PA2000 的酵母于完全

YPD 培养基中经约 8 代培养（16 h），经计算质粒 PA500 每代的丢失率为 16.2%，质粒

PA1000 每代的丢失率为 10.7%，质粒 PA2000 每代的丢失率为 13.8%。这说明它们在酵母中

都是不稳定的（表

2）。

3 小结与讨论

　　尽管真核生物的复制在进化中有很强的保守性，但不同物种的

DNA 复制起始位点之间

却缺少明显的一致序列或结构。酿酒酵母的复制起始位点由

11 bp 的 ACS 保守序列和几个辅

助序列（

B 区）组成。ACS 是复制起始识别蛋白 ORC 结合位点。ACS 的侧翼序列不保守，但

其对

ARS 的活性却是非常重要的[7]。

　　虽然在酵母中大多数

ARS 都有 ACS，但其中有些位点的使用频率比其他位点的更高，

且有一些潜在的复制起始位点在正常生长条件下从不使用，而一旦这些潜在的复制起始位

点序列克隆到质粒上，都能有效地作为复制起始位点行使其功能。因此，在酵母细胞核中染