参照文献进行生理生化鉴定，另采用 BIOLOG 全自动鉴定仪比对代谢指纹进行鉴定.采用

添加 5 μg · mL-1 的抗生素，浓度梯度为 50、100、400、500、800、1000、1200、1500、

2000 mg · L-1 的重金属盐的 LB 培养基培养 YH8，检测菌株的相关抗性.

2.2.5 16S

rDNA 基因序列的测定及分子系统发育树的构建 细菌基因组 DNA 采用 EasyPure Genomic

DNA Kit 试剂盒，依据说明书提取.16S rDNA 基因序列的获取参照文献.PCR 产物经琼脂糖电

泳检测纯化，送上海生工进行双向测序并拼接输出全序列，16S rDNA 序列用 BLAST 进行相

似性搜索和同源性比对，采用 ClustalX 1.8 进行序列匹配分析，通过 MEGA6.0 软件使用邻

接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树，利用 Bootstrap(1000 次重复)检验各分

支的置信度.

2.2.6 gyrB 基因序列的测定及分子系统发育树的构建

gyrB 基因是普遍存在于细菌中编码促旋酶 B 亚单位的基因，该基因进化速率快，每 100

万年的平均碱基替换率为 0.7%~0.8%，gyrB 基因弥补了非蛋白编码基因 16S rDNA 无法区分

近源种的缺陷.以提取的细菌基因组 DNA 为模板，采用 gyrB 的保守引物对 UP-1F/UP-2R 进行

PCR 扩增，PCR 反应体系及反应步骤参照文献.利用测序引物 UP-1S:5′

-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和 UP-2sr: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′双向测序并

连接，gyrB 序列构建系统发育树的方法同上.

2.3 优化降解条件

经单因素实验确定影响 YH8 降解苯酚的环境因素.以苯酚降解率为响应值，采用三步法

进行苯酚降解的优化.首先，利用 Plackett-Burman 设计选出对菌株降解苯酚效率影响较大

的因素，然后利用最陡爬坡设计逼近最佳区域，最后利用响应曲面法中的 Box-Benhnken 设

计进行实验.通过实验数据拟合响应面模型，最终确定最优降解条件并进行验证.实验数据借

助 SPSS 和 Design Expert 软件进行分析.

2.4 苯酚降解机理的研究

2.4.1 细胞粗酶液的提取

将筛选到的菌株 YH8 接种至选择培养基(含 1000 mg ·L-1 苯酚)和 LB 培养基中，

30 ℃、

200 r · min-1 振荡培养 32h，取对数生长期末期菌液 50 mL，4 ℃、12000 r · min-1

离心 10 min，上清液即为胞外粗酶液，于-20 ℃冻存.菌体沉淀用 pH 7.0 的磷酸缓冲液清

洗两次后，重悬于磷酸缓冲液中.在冰浴中，用 HUP-400A 型超声波细胞破碎仪破碎细胞，超

声破碎 30 s，间隔 30 s，连续处理 10 min.于 4 ℃、13000 r · min-1 离心 20 min，上清

液即为胞内粗酶液，于-20 ℃冻存.